近日，重点实验室张还添副教授团队与暨南大学附属第一医院查振刚教授、暨南大学药学院张荣华教授团队共同在Bone Research发文，从临床问题出发，通过构建全/条件基因敲除鼠证实了三结构域蛋白21（Trim21）在调节成骨及破骨分化中的关键作用，蛋白组学系统揭示了Trim21通过调控YAP1/β-catenin信号影响骨量并参与骨质疏松症发生及进展的机制。该研究阐明Trim21是影响成骨/破骨分化的双向调节新靶点，为骨质疏松症和骨质疏松性骨折的治疗提供了新的线索。
随着人口老龄化社会的到来，中老年骨质疏松症以及骨质疏松性骨折的患病率逐年增长，骨质疏松的预防和治疗已经成为临床上一个重要的现实问题。骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病。目前，临床上防治骨质疏松症的药物主要包括骨吸收抑制剂如双磷酸盐类、RANKL单克隆抗体及降钙素等，骨形成促进剂如甲状旁腺素类似物。近年来，寻找可同时具备抑制破骨和促进成骨形成的双重作用靶点得到了越来越多研究者的关注。
该团队长期从事Trim21泛素化调控机制及其在骨骼疾病中的应用研究。在前期研究中，研究团队发现Trim21调控骨肉瘤细胞的衰老及成骨分化，并通过自噬机制调节成骨分化关键转录因子如RUNX2的表达，相关成果已发表在Aging（2020）和Cell Death & Diseases（2021）。基于上述研究，该团队拟进一步探索Trim21在骨质疏松症疾病中的可能作用。研究者收集了行关节置换术患者（不同骨密度）及骨质疏松症模型（OVX）小鼠的骨骼标本，通过qRT-PCR定量发现Trim21在骨质疏松骨标本中的表达水平显著高于正常骨密度标本。从发育生物学的角度，该团队证实了全基因敲除Trim21缺失可促进生长板的发育，并在一定程度上增加了胫骨骨量。
图1 Trim21在骨质疏松骨标本中表达升高，其缺失导致骨量增加
该研究进一步证实了Trim21缺失可促进成骨分化。采用骨髓间充质干细胞（MSCs）、原代成骨细胞（OBs）及成骨前体细胞系MC3T3-E1等体外模型，发现诱导成骨分化过程中Trim21的表达水平下调。进一步，研究者提取了Trim21敲除鼠的MSCs及OBs并分别进行成骨分化诱导，发现Trim21-/-组来源的细胞成骨分化能力显著高于Trim21+/+组，成骨相关基因的表达也明显增加。构建颅骨缺损体内模型证实Trim21敲除可加速成骨分化并促进骨缺损的愈合。
图2 Trim21的缺失增加成骨细胞活性并促进骨形成
同时，该团队也证实了Trim21的敲除可减少破骨分化。通过提取全敲鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMMs）并行破骨分化诱导，发现Trim21-/-组的破骨分化较WT组减弱，破骨相关基因的表达也显著下调。为了进一步验证，研究者分别在RAW264.7细胞中通过siRNA敲低Trim21，或在Trim21flox/flox的BMMs中进行感染Cre慢病毒以诱导敲除Trim21；结果均表明Trim21表达水平下降后，TRAP阳性破骨细胞的数量及及核数目均减少，提示干扰Trim21的表达抑制了破骨细胞分化。通过共培养系统，研究者还发现Trim21-/-小鼠来源的MSCs通过旁分泌的途径抑制了破骨细胞的形成。
图3 Trim21的缺失抑制破骨细胞的形成及分化
为探讨Trim21调控成骨分化的机制，研究者采用了蛋白组学筛选分析。与Trim21+/+来源的BMSCs相比较，Trim21-/-来源的BMSCs BCL9及AXIN1等蛋白的表达水平更高。鉴于BCL9及AXIN1均是OB分化过程中Wnt/β-catenin信号传导通路的关键蛋白，且蛋白质组学富集到YAP1信号通路，研究者采用Co-IP及BiFC技术证实Trim21和β-catenin/BCL9和YAP1蛋白复合物存在相互作用。通过过表达Trim21，进一步证实Trim21在成骨诱导下与BCL9/β-catenin和YAP1通过互作影响成骨分化的作用。
图4 YAP1/β-catenin信号对Trim21介导的成骨分化至关重要
鉴于Trim21在免疫及炎症调控中起关键作用，研究者进一步探讨了Trim21对炎性骨丢失的影响。首先，对MC3T3-E1和OB细胞分别采用脂多糖（LPS）处理，结果表明Trim21敲除能逆转LPS对OB细胞的分化抑制。进一步，在敲除鼠中建立LPS刺激的炎性骨丢失模型，发现Trim21-/-组骨丢失较Trim21+/+组少。与全敲鼠的结果一致，条件性敲除鼠Ctsk-cre; Trim21flox/flox能部分缓解LPS诱导的骨丢失。
图5 Trim21的缺失对LPS诱导的骨丢失有保护作用
进一步地，研究者在全敲鼠中构建了卵巢去势（OVX）骨质疏松模型，结果发现Trim21-/-的骨量较Trim21+/+组升高，免疫组化和TRAP染色证实Trim21可通过调控YAP1的表达而影响OBs和OCs的耦合机制，从而抑制骨质疏松的进程。
图6 Trim21通过YAP1信号调节OVX诱导的骨丢失
综上所述，该合作团队通过采用全/条件基因敲除鼠、细胞及分子生物学进一步揭示Trim21是骨质疏松防治双向调节新靶点，为成骨/破骨双靶向药物的研究提供了新线索，为骨骼退行性疾病的相关研究提供了新范式。
重点实验室成员张还添副教授为本文最后通讯作者。本研究得到了国家中医药管理局办公室、国家卫生计生委办公厅，中央军委后勤保障部卫生局三部委发文的重大疑难疾病中西医临床协作试点项目、国家重点研发计划、国家自然科学基金-面上项目、广东省自然科学基金-杰出青年项目等项目的支持。该研究同时被中国科学报报道。
图7 中国科学报报道截图
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41413-023-00296-3
报道链接：https://news.sciencenet.cn/htmlnews/2023/10/511268.shtm